常用設備
準備室的設備：
單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放置未消毒物品）、儲品柜（放置消毒過的物品）、包裝臺。配液室的設備：扭力天平和電子天平（稱量藥品）、 PH 計（測量培養用液 PH 值）、
磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。
培養室的設備：
液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統、低溫冰箱（ -80℃ ）、空調、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄）。
必須放在無菌間的設備：
離心機（收集細胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、 CO2 孵箱（孵育培養物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機、 4℃ 冰箱（放置 serum 和培養用液）。
無菌操作基本技術
無菌室的滅菌：
1.定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用 3‰ 來蘇爾或者新潔爾滅或者 0.5 ％過氧乙酸擦拭。
2.CO2 孵箱（培養箱）滅菌：先用 3‰ 新潔爾滅擦拭，然后用 75 ％酒精擦拭或者 0.5 ％過氧乙酸，再用紫外燈照射。
3.實驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統各 20-30 分鐘 。
4.實驗后滅菌：用 75 ％酒精（ 3‰ 新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。
5.定期檢測下列項目：鋼瓶之CO2 壓力；CO2培養箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)；無菌操作臺內之airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(300 小時/預濾網，3000 小時/HEPA)。
6.水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水。
實驗人員的無菌準備：
1.肥皂洗手。
2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋
3.用75 ％酒精棉球擦凈雙手。
無菌操作的演示：
1.凡是帶入超凈工作臺內的酒精、 PBS 、培養基、胰蛋白酶的瓶子均要用 75 ％酒精擦拭瓶子的外表面
2.靠近酒精燈火焰操作。
3.器皿使用前必須過火滅菌
4.繼續使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。
5.各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。
6.吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。
器械的清洗和消毒
玻璃器械洗消：
一、新的玻璃器皿的洗消：
1.自來水刷洗，除去灰塵。
2.烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入 5 ％稀鹽酸中 12 小時以除去臟物、鉛、砷等物。
3.刷洗、烘干： 12 小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。
4.泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g ：濃硫酸 200ml ：蒸餾水 1000ml ）浸泡12小時，然后從酸缸內撈出器皿用自來水沖洗 15 次，**后蒸餾水沖洗 3-5 次和用雙蒸水過 3 次。
5.烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。
6.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內蓋好蓋子，打開開關和安全閥，當蒸氣成直線上升時，關閉安全閥，當指針指向 15 磅 時，維持 20-30 分鐘。
7.高壓消毒后烘干
二、舊的玻璃器皿的洗消：
1.刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。
2.泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液）， 12 小時后從酸缸內撈出器皿立即用自來水沖洗（避免蛋白質干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗 3 次。
3.烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。
4.高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內，蓋好蓋子，打開開關和安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當蒸氣成直線冒出 3-5 分鐘后，關閉安全閥，氣壓表指數隨之上升，當指針指向 15 磅 時，調節電開關維持 20-30 分鐘即可。（玻璃培養瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上）
5.烘干備用：因為高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內烘干備用。金屬器械洗消：金屬器皿不能泡酸，洗消時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用 75 ％酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內包裝好在高壓鍋內 15 磅 高壓（ 30 分鐘）消毒，再烘干備用。
橡膠和塑料：
橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據不同品質進行如下的處理程序：
1.針式濾器帽不能泡酸液 , 用 NaOH 泡 6-12 小時 , 或者煮沸 20 分鐘 , 在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時注意光面朝上 ( 凹向上 ) ，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內 15 磅 30 分鐘消毒，再烘干備用。注意在超凈臺內取出使用時應該立即將螺旋旋緊。
2.膠塞烘干后用 2 ％氫氧化鈉溶液煮沸 30 分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理 30 分鐘），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液 30 分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。**后裝入鋁盒內高壓消毒，烘干備用。
3.膠帽，離心管帽烘干后只能在 2 ％氫氧化鈉溶液中浸泡 6-12 小時（切記時間不能過長），自來水洗凈，烘干。然后再泡入鹽酸液 30 分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。**后裝入鋁盒內高壓消毒，烘干備用。#p#分頁標題#e#
4.膠頭可用 75 ％酒精浸泡 5 分鐘，然后紫外照射后使用即可。
5.塑料培養瓶，培養板，凍存管.
6.其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用 70 ％酒精浸泡消毒。塑料培養皿打開蓋子，放在超凈臺臺面上，直接暴露在紫外線下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用 2—3 周時間洗除殘留的氧化乙烯。用 20000—100000rad 的 r 射線消毒塑料制品效果**好。為了防止清洗器材已消毒與末消毒發生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水，在包裝紙上作一記號，平時這種墨水不帶痕跡，一經高溫，即出現字跡，從而可以判定它們是否消毒。密寫墨水的配制：氯化鉆 (CoC12·6H2o) 2g ，30％鹽酸 10m 1，蒸餾水 88m1 。
注意事項：
1.嚴格執行高壓鍋的操作規程：高壓消毒時，先檢查鍋內是否有蒸餾水，以防高壓時燒干，水不能過多因為其將使空氣流暢受阻，會降低高壓消毒效果。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時爆炸。
2.安裝濾膜時注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過濾的作用。
3.注意人體的防護和器皿的完全浸泡： A. 泡酸時要戴耐酸手套，防止酸液濺起傷害人體。 B. 從酸缸內撈取器皿時防止酸液濺到地面，會腐蝕地面。 C. 器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以防止 泡酸不徹底。
細胞培養用液的配制與消毒
器材與試劑：
干粉型培養基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素 . 純凈水系統、電子天平、 PH 計、
磁力攪拌器。
具體步驟：
一、水的制備：
細胞培養用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水。
二、PBS 的制備與消毒 ( 也可用于其它 BSS ，如： Hanks ， D-Hanks 液的配制 ) ：
1.溶解定容：將藥品（ NaCl 8.0g ， KCl 0.2g ， Na2HPO4·H2O 1.56g ， KH2PO40. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準確定容** 1000ml ，搖勻即成新配制的 PBS 溶液。
2.移入溶液瓶內待消毒：將 PBS 倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內 8 磅 消毒 20 分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補充蒸發掉的水份。
三、胰蛋白酶溶液的配制與消毒：
胰蛋白酶的作用是使細胞間的蛋白質水解從而使細胞離散。不同的組織或者細胞對胰酶的作用反應不一樣。胰酶分散細胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關，在 pH 為 8.0 、溫度為 37℃ 時，胰酶溶液的作用能力**強。使用胰酶時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因 Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白質克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應選用不含 Ca2+ 、 Mg2+ 的 BSS ，如： D-Hanks 液。終止消化時，可用含有血清培養液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細胞的作用。
1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為 0.25 ％，用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調 PH 到 7.2 左右）或 PBS （ D-hanks ）液中。攪拌混勻，置于 4℃ 內過夜。
2.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺內用注射濾器（ 0.22 微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于 -20℃ 保存以備使用。
四、抗生素溶液的配制
1.所用純凈水（雙蒸水）需要 15 磅 高壓 20 分鐘滅菌。
2.具體操作均在超凈臺內完成。青霉素是 80 萬單位 / 瓶，用注射器加 4ml 滅菌雙蒸水。鏈霉素是 100 萬單位 / 瓶，加 5ml 滅菌雙蒸水，即每毫升各為 20 萬單位。
3.使用時溶入培養液中，使青鏈霉素的濃度**終為 100 單位 /ml 。 1 單位＝ 1 微克？
4.細胞庫之細胞培養基不加抗生素
5.培養自ATC引進之細胞株，培養基中不加抗生素。
6.培養自其它實驗室引進之細胞株，制作token freeze 前培養基須添加抗生素，待token freeze 通 過污染測試后，大量培養時則不加抗生素。
7.寄送活細胞時，須將培養液充滿整個 flask 時，則須添加抗生素 。 (penicillin 100 units/ml +
streptomycin 100 ug/ml)
8.若要檢測mycoplasma，則培養基內不可添加gentamicin，因gentamicin 會抑制 mycoplasma 生長。
9.去除細菌污染之抗生素混合配方 : penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml,
neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml
注意混合使用后藥物毒性會增強。
10.抗生素使用種類與濃度：
工作濃度. 儲存溫度. 殺滅細菌
penicillin 100 units/ml -20℃ G(+) bacteria
streptomycin 100 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria
gentamicin 50 ug/ml -20℃ G(+) and G(-) bacteria, mycoplasma
amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds
nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds
fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds
五、RPMI1640 的制備與消毒：
1.溶解、調 PH 值、定容：先將培養基粉劑加入培養液體積 2/3 的雙蒸水中 , 并用雙蒸水沖洗包裝袋 2-3 次 ( 沖洗液一并加入培養基中 ), 充分攪拌**粉劑全部溶解 , 并按照包裝說明添加一定的藥品 . 然后用注射器向培養基中加入配制好的青鏈霉素液各 0.5ml, 使青鏈霉素的濃度**終各為 100 單位 /ml 。然后用一個當量的鹽酸和 NaOH 調 PH 到 7.2 左右。**后定容** 1000ml ，搖勻。#p#分頁標題#e#
2.安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。
3.抽濾：配制好的培養液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺內過濾。
4.分裝：將過濾好的培養液分裝入小瓶內置于 4℃ 冰箱內待用。
5.使用前要向 100ml 培養液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液（ 4℃ 時兩周有效）。
六、血清：
1.血清的滅火：細胞培養常用的是小牛血清，新買來的血清要在 56℃ 水浴中滅火 30 分鐘后，再經過抽濾方可加入培養基中使用。
血清必須貯存于–20 ～ -70℃，若存放于4℃，請勿超過一個月。如果一次無法用完一 瓶，可將40～45 ml 分裝于無菌50 ml 離心管中，由于血清結凍時體積會增加約10 %，必須預留此膨脹體積之空間，否則易發生污染或容器凍裂之情形。
2.一般廠商提供之血清為無菌，不需再無菌過濾。若發現血清有許多懸浮物，則可將血清入培養基內一起過濾，勿直接過濾血清。
3.瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20℃ 或–70℃ **4℃冰箱溶解**，**室 溫下全溶后再分裝，一般 50 ml 無菌離心管可分裝40～45 ml。在溶解過程中須規則搖晃均勻(小心勿造成氣泡 ，使溫度與成分均一，減少沈淀的發生。勿直接由－２０ ℃ 直接 **３７ ℃ 解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質凝結而發生沈淀。
4.heat-inactivation 是指56 ℃, 30 分鐘加熱已完全解凍之血清。加熱過程中須規則搖晃均勻。此熱處理之目的是使血清中之補體成份(complement) 去活化。除非必須，一般建議作此熱處理，因為會造成沈淀物之顯著增多，且會影響血清之品質。補體參與之反應有：cytolytic activities, contraction of smooth muscle, release of histamine from mast cells and platelets, enhanced phag℃ytosis, chemotaxis and activation of lymph℃ytic and macrophage cell type。
5.勿將血清置于３７℃太久，若在３７℃ 放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定之成份亦會因此受到破壞，而影響血清之品質。
6.血清之沉淀物
6.1 凝絮物：發生之原因有許多種，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein) 變性 及解凍后血清中存在之血纖維蛋白(fibrin) 造成，這些凝絮沈淀物不會影響血清本身之品質。若欲減少這些凝絮沈淀物，可用離心3000 rpm, 5 min 去除，或離心后上清液可以加入培養基中一起過濾。不建議用過濾步驟去除這些凝絮沈淀物，因為會阻塞過濾膜。
6.2 顯微鏡下觀察之“小黑點”：通常經過熱處理之血清，沉淀物的形成會顯著的增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察像是小黑點 ，常會誤認為血清遭受污染，而將血清放在３７℃中欲培養此微生物“，但在37 ℃ 環境下，又會使此沈淀物增多，更會誤認為微生物之增殖，但以培養細菌之培養基檢測，又沒有污染。一般而言，此黑點應不會影響細胞之生長，但若懷疑此血清之品應立即停用，更換另一批號的血清。
七、HEPES 溶液：
HEPES 的化學全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（ N'-a-hydroxythylpiperazine-N'- ethanesulfanic acid ）。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定的 pH 范圍。使用終濃 度為 10-50mmol/L ，一般培養液內含 20mmol/LHEPES 即可達到緩沖能力。
1mol/L HEPE 緩沖液配制方法如下：
準確稱取 HEPTS 238.3g ，加入新鮮三蒸水定容** 1L 。過濾除菌，分裝后 4℃ 保存。
注意：因為現在市售 HEPES 為約 10g 包裝的小瓶，所以可根據實際情況靈活配制，但是要保證培養液內 HEPES 的終濃度仍然為 20m mol/L 。如：稱取 4.766 克 HEPES 溶于 20ml 三蒸水中，過濾除菌后可完全（ 20ml ）加入 1L 培養液中，或者每 100ml 培養液中加入 2ml 即可。
八、谷氨酰胺：
合成培養基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質，谷氨酰胺缺乏要導致細胞生長不良甚**死亡。在配制各種培養液中都應該補加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩定， 4℃ 下放置 1 周可分解 50 ％，故應單獨配制，置于 -20℃ 冰箱中保存，用前加入培養液。加有谷氨酰胺的培養液在 4℃ 冰箱中儲存 2 周以上時，應重新加入原來的谷氨酰胺。一般培養液中谷氨酰胺的含量為 1 ～ 4mmol/L 。可以配制 200mmol/L 谷氨酰胺液貯存，用時加入培養液。配制方法為，谷氨酰胺 2.922g 溶于三蒸水加** 100ml 即配成 200mmol/L 的溶液，充分攪拌溶解后，過濾除菌，分裝小瓶， -20℃ 保存，使用時可向 100ml 培養液中加入 1ml 谷氨酰胺溶液。
九、肝素溶液的配制：
含有肝素的培養液可以使內皮細胞純度提高，肝素加入全培養液中**終濃度為 50ug/ml 。因為現在市售的多為肝素鈉，包裝為約為 0.56 克 / 瓶，配制時，可將其溶于 100ml 三蒸水中，定容，過夜，然后過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為 ℃ 。使用時，向 100ml 培養液中加入 1ml （精確可加入 0.9ml ）即可。
十、Ⅰ型膠原酶：
0.1 ％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因為 Ⅰ 型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入 10ml 小瓶 -20℃ 保存。
十一 、明膠溶液：#p#分頁標題#e#
因為明膠難于過濾，所以配制 0.1 ％明膠溶液必須用無菌的 PBS 配制。所以制備過程中必須要注意無菌操作。shou要的問題是如何無菌準確稱量 0.1 克 （配成 100ml 溶液） — 即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是 01. 的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入 50ml 小瓶中， 4℃ 保存。
注意事項：
1.配制溶液時必須用新鮮的蒸餾水。
2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑 0.45 微米 和 0.22 微米濾膜各一張，放置位置為 0.45 的位于 0.22 微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。
3.配制 RPMI1640 培養基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養液 PH 值**終為 7.2 ，可在配制時調 PH ** 7.4 。
細胞培養的一般過程
一、準備工作
準備工作對開展細胞培養異常重要，工作量也較大，應給予足夠的重視，推備工作中某一環節的疏忽可導致實驗失敗或無法進行。準備工作的內容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無菌室或超凈臺的清潔與消毒，培養箱及其他儀器的檢查與調試，具體內容可參閱有關文獻。
二、取材
在無菌環境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定），經過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的**培養稱為原代培養。R
理論上講各種動物和人體內的所有組織都可以用于培養，實際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個體的組織容易培養，分化程度低的組織比分化高的容易培養，腫瘤組織比正常組織容易培養。取材后應立即處理，盡快培養，因故不能馬上培養時，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置 4℃的培養液中保存。取組織時應嚴格保持無菌，同時也要避免接觸其他的有害物質。取病理組織和皮膚及消化道上皮細胞時容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。
由組織并分離分散細胞的方法可參閱有關文獻。
三、培養
將取得的組織細胞接入培養瓶或培養板中的過程稱為培養。如系組織塊培養，則直接將組織塊接入培養器皿底部，幾個小時后組織塊可貼牢在底部，再加入培養基。如系細胞培養，一般應在接入培養器皿之前進行細胞計數，按要求以一定的量（以每毫升細胞數表示）接入培養器皿并直接加入培養基。細胞進入培養器皿后，立即放入培養箱中，使細胞盡早進入生長狀態。
正在培養中的細胞應每隔一定時間觀察一次，觀察的內容包括細胞是否生長良好，形態是否正常，有無污染，培養基的 PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對培養溫度和 CO2濃度也要定時檢查。
一般原代培養進入培養后有一段潛伏期（數小時到數十天不等），在潛伏期細胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過了潛伏期后細胞進入旺盛的分裂生長期。細胞長滿瓶底后要進行傳代培養，將一瓶中的細胞消化懸浮后分**兩到三瓶繼續培養。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細胞一般只能傳幾十代，而轉化細胞系或細胞株則可無限地傳代下去。轉化細胞可能具有惡性性質，也可能僅有不死性（Immortality）而無惡性。
培養正在生長中的細胞是進行各種生物醫學實驗的良好材料。
四、凍存及復蘇
為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度?－196℃，將細胞收集**凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養基，以一定的冷卻速度凍存，**終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。
復蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入 37℃水中，使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養器皿中進行培養。
凍存過程中保護劑的選用、細胞密度、降溫速度及復蘇時溫度、融化速度等都對細胞活力有影響。
細胞原代培養
一、原理
將動物機體的各種組織從機體中取出，經各種酶（常用胰蛋白酶）、螯合劑（常用 EDTA）或機械方法處理，分散成單細胞，置合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養。 ?{uD3
二、儀器、材料及試劑
儀器：培養箱（調整** 37℃），培養瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術器械、血球計數板、
離心機、水浴箱（37℃）
材料：胎鼠或新生鼠
試劑：1640培養基（含 20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒
三、操作步驟
（一）胰酶消化法
1、器材：將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置 75%酒精泡 2—3秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內（或將新生小鼠在超凈臺內）解剖取肝臟，置平皿中。
2、用 Hank’s液洗滌三次，并剔除脂肪，結締組織，血液等雜物。
附：Hank’s液配方：5m KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖 1.0g，Na2HPO4·H2O 0.06g，加 H2O** 1000mlG1
注：Hank’s液可以高壓滅菌。4℃下保存。
3、用手術剪將肝臟剪成小塊（1mm2），再用 Hank’s液洗三次，轉移**小青霉素瓶中。
4、視組織塊量加入 5—6倍的 0.25%胰酶液，37℃中消化 20—40分鐘，每隔 5分鐘振蕩一次，或用吸管吹打一次，使細胞分離。#p#分頁標題#e#
5、加入 3—5ml培養液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。
6、靜置 5—10分鐘，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中。
7、1000rpm，離心 10分鐘，棄上清液。
8、加入 Hank’s液 5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。
9、加入培養液 l—2 ml（視細胞量），血球計數板計數。
10、將細胞調整到 5×105/ml左右，轉移** 25ml細胞培養瓶中，37℃下培養。
上述消化分離的方法是**基本的方法，在該方法的基礎上，可進一步分離不同細胞。細胞分離的方法各實驗室不同，所采用的消化酶也不相同（如膠原酶，透明質酶等）。
（二）組織塊直接培養法
自上方法第 3步后，將組織塊轉移到培養瓶，貼附與瓶底面。翻轉瓶底朝上，將培養液加**瓶中，培養液勿接觸組織塊。入 37℃靜置 3—5小時，輕輕翻轉培養瓶，使組織浸入培養液中（勿使組織漂起），37℃繼續培養。
四、注意事項
1、自取材開始，保持所有組織細胞處于無菌條件。細胞計數可在有菌環境中進行。
2、在超凈臺中，組織細胞、培養液等不能暴露過久，以免溶液蒸發。
3、凡在超凈臺外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞，以防止細菌落入。
細胞傳代培養（消化法）
一、原理
細胞在培養瓶長成致密單層后，已基本上飽和，為使細胞能繼續生長，同時也將細胞數量擴大，就必須進行傳代（再培養）。
傳代培養也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以，而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。
二、材料和試劑
1.無菌磷酸生理緩沖液(Dulbecco’s phosphate-buffered saline, Ca++/Mg++ free, D-PBS, GibcoBRL 21600-010)
2.trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin-0.53mM EDTA-4Na, GibcoBRL 25300-062): 以10 ml 分裝于15 ml 無菌離心管中，保存于–20 ℃，使用前放在37 ℃ 水槽回溫。
3.新鮮培養基
4.無菌吸管/離心管/培養瓶
三、操作步驟
（1）傳代前準備：
1.預熱培養用液：把已經配制好的裝有培養液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內預熱。
2.用75％酒精擦拭經過紫外線照射的超凈工作臺和雙手。
3.正確擺放使用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。
4.點燃酒精燈：注意火焰不能太小。
5.準備好將要使用的消毒后的空培養瓶，放入微波爐內高火，8分鐘再次消毒。
6.取出預熱好的培養用液：取出已經預熱好的培養用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺內。
7.從培養箱內取出細胞：注意取出細胞時要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺面，再在鏡下觀察細胞。
8.打開瓶口：將各瓶口一一打開，同時要在酒精燈上燒口消毒。
（2）胰蛋白酶消化；
1.加入消化液：小心吸出舊培養液，用PBS清洗（沖洗），加入適量消化液（胰蛋白酶液），注意消化液的量以蓋住細胞**好，**佳消化溫度是37℃。
2.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察消化細胞，若胞質回縮，細胞之間不再連接成片，表明此時細胞消化適度。
3.吸棄消化液加入培養液：棄去胰蛋白酶液，注意更換吸管，加入新鮮的培養液。
（3）吹打分散細胞：
1.吹打制懸：用滴管將已經消化細胞吹打成細胞懸液。
2.吸細胞懸液入離心管：將細胞懸液吸入10ml離心管中。
3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺式
離心機中，以1000轉/分鐘離心6-8分鐘。
4.棄上清液，加入新培養液：棄去上清液，加入2ml培養液，用滴管輕輕吹打細胞制成細胞懸液。
（4）分裝稀釋細胞：
1.分裝：將細胞懸液吸出分裝**2-3個培養瓶中，加入適量培養基旋緊瓶蓋。
2.顯微鏡下觀察細胞：倒置顯微鏡下觀察細胞量，必要是計數。注意密度過小會影響傳代細胞的生長，傳代細胞的密度應該不低于5×105/ml。**后要做好標記。
（5）繼續培養：用酒精棉球擦拭培養瓶，適當旋松瓶蓋，放入CO2培養箱中繼續培養。傳代細胞2小時后開始貼附在瓶壁上。當生長細胞鋪展面積占培養瓶底面積25％時為一個＋，占50％為＋＋，占75％時為＋＋＋。
**不同類型細胞操作**
（1）附著型胞(adherent cell)
1.吸掉舊培養液。
2.用D-PBS 洗滌細胞一**二次。
3.加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37 ℃ 作用數分鐘，于倒立顯微鏡下觀察，當細胞將要分離而呈現圓粒狀時，吸掉trypsin-EDTA 溶 液。(若不移去trypsin-EDTA，則在 trypsin-EDTA trypsin作用后，加入適量含血清 之新鮮培養基終止作用，離心后再吸掉上清液。
4.輕拍培養瓶使細胞自瓶壁脫落，加入適量之新鮮培養基，以吸管上下吸放數次以打散細胞團塊，混和均勻后，依稀釋比例轉移**新的培養瓶中，以正常培養條件培養。
（2）懸浮型細胞(suspension cell)
1.吸出細胞培養液，放入離心管中，離心1000 rpm 5 分鐘。
2.吸掉上清液，加入適量之新鮮培養基，混和均勻后，依稀釋比例轉移**新的培養瓶中，以正常培養條件培養。
（3） 融合瘤(hybridoma)
有些 hybridoma cell需培養三天以上才會產生抗體，若是更換培養基，則可能會失去抗體。因此繼代培養不需離心后更換培養基，直接添加新鮮培養基稀釋細胞濃度即可。若體積太大，可傾斜放置，或分殖**新培養瓶中。#p#分頁標題#e#
**傳代細胞培養注意事項**
1.嚴格的無菌操作
2.適度消化：消化的時間受消化液的種類、配制時間、加入培養瓶中的量等諸多因素的影響，消化過程中應該注意培養細胞形態的變化，一旦胞質回縮，連接變松散，或有成片浮起的跡象就要立即終止消化。
附：EDTA（0.02％乙二胺四乙酸二鈉）消化液配方：
EDTA 0.20g，NaCl 8.00g， KCl 0.20g， KH2PO4 0.02g， 葡萄糖 2.00g，0.5％酚紅4ml，加入蒸餾水定容**1000ml。10磅20min高壓滅菌，使用時調節PH值到7.4。注意EDTA不能被血清中和，使用后培養瓶要徹底清洗，否則再培養時細胞容易脫壁。
細胞計數及活力測定
一、原理
培養的細胞在一般條件下要求有一定的密度才能生長良好，所以要進行細胞計數。計數結果以每毫升細胞數表示。細胞計數的原理和方法與血細胞計數相同。
計算細胞數目可用血球計數盤或是Coulter counter 粒子計數器自動計數。 血球計數盤一般有二個chambers，每個chamber 中細刻9個1mm正方形再細刻16 個小格，深度均為0.1 mm。當chamber 上方蓋上蓋玻片后，每個大正方形之體積為1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用時，計數每個大正方形內之細胞數目，乘以稀釋倍數，再乘以104，即為每ml 中之細胞數目。
在細胞群體中總有一些因各種原因而死亡的細胞，總細胞中活細胞所占的百分比叫做細胞活力，由組織中分離細胞一般也要檢查活力，以了解分離的過程對細胞是否有損傷作用。復蘇后的細胞也要檢查活力，了解凍存和復蘇的效果。
存活測試之步驟為dye exclusion，利用染料會滲入死細胞中而呈色，而活細胞因細胞膜完整，染料無法滲入而不會呈色。一般使用藍色之trypan blue 染料，如果細胞不易吸收trypan blue，則用紅色之Erythrosin bluish 。
利用細胞內某些酶與特定的試劑發生顯色反應，也可測定細胞相對數和相對活力。
二、儀器、用品與試劑
0.4 % w/v 臺盼蘭trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
Erythosin bluish stain
取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca++/Mg++ free saline
血球計數盤及蓋玻片(Hem℃ytometer and coverslip)
計數器(counter)
低倍倒立顯微鏡
粒子計數器(Coulter counter, Coulter Electronics)
三、操作步驟
（一）細胞計數
3.1. 取50ml 細胞懸浮液與50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等體積混合均勻于1.5ml 小離心管中。
3.2. 取少許混合液(約15ml) 自血球計數盤chamber 上方凹槽加入，蓋上蓋玻片，于100 倍倒立顯微鏡下觀察，活細胞不染色，死細胞則為藍色 ( 或紅色- Erythrosin bluish) 。
3.3. 計數四個大方格之細胞總數，再除4，乘以稀釋倍數(**少乘以2，因與trypan blue等體積混合)，**后乘以104 ，即為每ml 中細胞懸浮液之細胞數。若細胞位于線 上，只計上線與右線之細胞(或計下線與左線之細胞)。
3.4. 若不用血球計數盤，可用Coulter counter 作自動計數，惟無法辨別死細胞或活細 胞。
然后按下式計算：
細胞數/ml＝4大格細胞總數x 2/ 4×10000
注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占 10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。
（二）細胞活力
1、將細胞懸液以 0.5ml加入試管中。
2、加入 0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色 2一 3分鐘。
3、吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。
4、鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數，計細胞活力。
死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。
活力測定可以和細胞計數合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用 。
范例：
T75 monolayer culture 制成10ml 細胞懸浮液，取0.1 ml 溶液與0.1ml trypan blue 混合均勻于試管中，取少許混合液加入血球計數盤，計數四大方格內之 細胞數目。
活細胞數/方格：55 ,62, 49, 59
死細胞數/方格：5, 3, 4, 6
細胞總數= 243
平均細胞數/方格= 60.75
稀釋倍數= 2
細胞數/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106
細胞數 /flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106
存活率：225/243﹦92.6 %
（三）MTT法測細胞相對數和相對活力
活細胞中的琥珀酸脫氫酶可使 MTT分解產生蘭色結晶狀甲贊顆粒積于細胞內和細胞周圍。其量與細胞數呈正比，也與細胞活力呈正比。
l、細胞懸液以 1000rpm離心 10分鐘，棄上清液。
2、沉淀加入 0.5－1ml MTT，吹打成懸液。
3、37℃下保溫 2小時。
4、加入 4—5 ml酸化異丙醇（定容）。打勻。
5、1000 rpm離心，取上清液酶標儀或分光光度計 570nm比色，酸化異丙醇調零點。
注意：MTT法只能測定細胞相對數和相對活力，不能測定細胞**數。
附：
1、0.4%臺盼蘭染液配制：臺盼蘭 0.4克 加雙蒸水** 100 ml。Cbeqe
2、MTT配制：MTT 0.5克，溶于 100 ml的磷酸緩沖液或無酚紅的基礎液中。4℃下保存。
3、酸化異丙醇配制：異丙醇中加入 HCl使**終達 0.04mol/L。
細胞的冷凍保存
1.注意事項：
1.1.欲冷凍保存之細胞應在生長良好(log phase) 且存活率高之狀態，約為80 – 90 ％致密度。
1.2.冷凍前檢測細胞是否仍保有其特有性質，例如hybridoma 應在冷凍保存前一**二日測試是否有抗體之產生。不宜將凍存細胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內過久，低溫損傷主要發生在這一溫度區內，是“危險溫區”。#p#分頁標題#e#
1.3.注意冷凍保護劑之品質。DMSO 應為試劑級等級，無菌且無色(以0.22 micron FGLP Telflon 過濾或是直接購買無菌產品，如Sigma D-2650)，以5~10 ml 小體積分裝，4 ℃ 避光保存，勿作多次解凍。使用DMSO前，不需要進行高壓滅菌，它本身就有滅菌的作用。高壓滅菌反而會破華它的分子結構，以**于降低冷凍保護效果。在常溫下，DMSO對人體有害，故在配制時**好戴上手套操作。Glycerol 亦應為試劑級等級，以高壓蒸汽滅菌后避光保存。在開啟后一年內使用，因長期儲存后對細胞會有毒性。
1.4.冷凍保存之細胞濃度：
1.4.1.normal human fibroblast: 1~3 x 106 cells/ml
1.4.2.hybridoma: 1~3 x 106 cells/ml，細胞濃度不要太高，某些ybridoma 會因冷凍 濃度太高而在解凍24 小時后死去。
1.4.3.adherent tumor lines: 5~7 x 106，依細胞種類而異。Aden℃arcinoma 解凍后須較高之濃度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。
1.4.4.other suspensions: 5~10 x 106 cells/ml, human lymph℃yte須**少5 x 106 cells/ml
1.5.冷凍保護劑濃度為5 或10 ％ DMSO，若是不確定細胞之冷凍條件，在做冷凍保存之同時，亦應作一個backup culture，以防止冷凍失敗。
1.6.冷凍方法：
1.6.1.傳統方法： 4℃ 10分鐘--->-20℃ 30分鐘---> -80℃ 16-18小時（或隔夜）--->液氮槽vapor phase 長期儲存。
1.6.2. 程序降溫：利用等速降溫機以–1 ～ -3 ℃/分鐘之速度由室溫降**–120 ℃，放在液氮槽vapor phase 長期儲存。適用于懸浮型細胞與hybridoma 之保存。
2.材料
2.1.生長良好之培養細胞
2.2.新鮮培養基
2.3.DMSO (Sigma D-2650)
2.4.無菌塑料冷凍保存管(Nalgene 5000-0020)
2.5.0.4 ％ w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061)
2.6.血球計數盤與蓋玻片
2.7.等速降溫機(KRYO 10 Series II)
3.步驟：
3.1.冷凍前一日前更換半量或全量培養基，觀察細胞生長情形。
3.2.配制冷凍保存溶液(使用前配制)：將DMSO 加入新鮮培養基中，**后濃度為5-10 ％，混合均勻，置于室溫下待用。
3.3.依細胞繼代培養之操作，收集培養之細胞，取少量細胞懸浮液(約0.1 ml) 計數細胞濃度及凍前存活率。
3.4.離心，去除上清液，加入適量冷凍保存溶液，使細胞濃度為1-5 x 106 cells/ml，混合均勻，分裝于已標示完全之冷凍保存管中，1 ml/vial，并取少量細胞懸浮液作污染檢測。
3.5.冷凍保存方法1: 冷凍管置于4 ℃ 10 分鐘→ -20 ℃ 30 分鐘→ -80 ℃ 16～18 小時(或隔夜) → 液氮槽vapor phase 長期儲存。
3.6.冷凍保存方法2: 冷凍管置于已設定程序之等速降溫機中，再放入液氮槽中。程序為: program 7: HB CELL
細胞活化、細胞復蘇
1.收到細胞株包裹時， 請檢查細胞株冷凍管是否有解凍情形， 若有請立即通知。細胞株請盡速開始培養， 或立即冷凍保存(置于–70 °C， 隔夜后， 移到liq N2)。
細胞復蘇的原則－快速融化：
必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化**37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶，對細胞造成損害。
具體操作
一、實驗前準備：
1.將水浴鍋預熱**37℃
2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。
3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等等。
二、取出凍存管：
1.根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。
2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。
三、迅速解凍：
1.迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化。
2.約1-2min后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內。
四、平衡離心：用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3min
五、制備細胞懸液：
1.吸棄上清液。
2.向離心管內加入10ml培養液，吹打制成細胞懸液。
六、細胞計數：細胞濃度以5×105/ml為宜。
七、培養細胞
將復合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內，將培養瓶放入37℃和5％CO2的培養箱內2-4小時（或者24-48小時）后換液繼續培養培養，換液的時間由細胞情況而定。
初學者易犯錯誤：
1.水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃。
2.水浴鍋內凍存管太多，導致傳熱不佳，使融化時間延長。
3.離心前忘記平衡，導致離心機損壞和細胞丟失。
4.一次復蘇細胞過多，忘記更換吸頭和吸管，導致細胞交叉污染。
（另：冷凍細胞解凍程序）
2.1.依據細胞株數據單指定之基礎培養基種類、血清種類和其它指定之成份和比例， 制備培養基。jue大多數之細胞均無法立即適應不同之基礎培養基或不同之血清種類， 若因實驗需要， 必須有所不同時， 務必以緩慢比例漸次改變培養基組成， 確定細胞適應后， 方進行所需之實驗。
2.2.FBS (fetal bovine serum, 胚牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和HS (horse serum, 馬血清)，對細胞而言差異極大，請務必依據細胞株資料單指定之血清種類培養之。
2.3.將培養基置于 37 °C水槽中回溫，回溫后噴以70 % 酒精并擦拭之， 移入無菌操作臺內。取 出冷凍管， 立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 水面高度不可接近或高過冷凍管之蓋沿， 否則易發生污染。輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化后， 以70 % ethanol 擦拭冷凍管外部， 移入無菌操作臺內。#p#分頁標題#e#
2.4.依據細胞種類和濃度，于無菌操作臺內取 10 ml培養基加** T25或 T75 flask中。取出已解凍 之細胞懸浮液，緩緩加入T25 或T75 flask 內之培養基， 混 合均勻，放入37 °C，5 % CO2 培養箱培養。
2.5.對jue大多數細胞而言，1 % 以下之冷凍保護劑DMSO，不會對細胞之貼附或活化有不良影響，不需立刻由解凍細胞中去除，待第二天確定細胞生長或貼附良好后再去除即可。唯對極少數因對DMSO 敏感或會造成細胞分化之細胞，需立即去除DMSO 者， 則可將解凍后之細胞懸浮液放入5 - 10 ml 培養基中,離心300 xg (約1000 rpm)，5 分鐘，小心移去上清液，加入適量新鮮培養基，將細胞均勻混合后， 轉移**培養瓶中， 再放入37 °C， 5 % CO2 培養箱培養。收到T25 flask 細胞時， 處理方式為︰
（1）于寄送過程中，為避免起泡造成細胞脫落死亡，T25 flask 均加滿培養基。請檢查flask 外觀，并于顯微鏡下觀察細胞生長狀況和有無污染現象，若有任何問題， 不要打開蓋子，請立即通知細胞實驗室。
（2）將原封之T25 flask 靜置于37 °C， 5 % CO2 培養箱中，使細胞回溫**37 °C， 并讓運送過程中少數脫落的細胞可再附著生長。隔天后，于無菌操作箱內取出flask內之培養基，(取出之培養基可以再使用)，僅留約5-10ml 培養基于flask 內，依 一般培養方式再將細胞置入培養箱中或細胞已長滿盤， 則將細胞做傳代培養。
